化学论文：特异性识别丁香菌酯亲水性分子印迹微球制备与表征

　　化学论文：特异性识别丁香菌酯亲水性分子印迹微球制备与表征

　　摘 要：通过沉淀聚合法成功合成了丁香菌酯亲水性分子印迹微球（HMIMs）。 HMIMs在水介质中对丁香菌酯的吸附能力高于普通的分子印迹聚合物（MIMs），并且HMIMs具有良好的亲水性。通过紫外分光光度计，扫描电子显微镜（SEM）和激光粒度分析仪对丁香菌酯亲水性印迹微球（HMIMs）和非印迹微球（HNIMS）进行了表征。与HNIMs相比，丁香菌酯对HMIMs的形态和大小具有重要影响。Langmuir吸附等温线说明HMIMs的每个结合位点都具有相同的吸附性能。 Lagergran准二级动力学模型表明丁香菌酯与HMIMs的吸附过程属于化学吸附。选择性吸附表明HMIMs具有对丁香菌酯高度特异性识别，并且与传统的C18相比具有更好的特异性吸附，传统的C18材料对目标物的吸附属于物理吸附，不具有特异性吸附。结果表明模板分子、功能单体与交联剂形成稳定复合物的印迹微球摩尔比例为1:4:20，在此比例下制备的HMIMs中主要存在一类结合位点，平衡解离常数分别为95.24 mg/L 和243.90 mg/L，最大吸附量分别为62.82mg/g和42.56mg/g，并且与非印迹微球（HNIMs）相比，HMIMs在水中对丁香菌酯具有更加优异的选择吸附性能。

　　关键词：丁香菌酯；亲水性分子印迹微球；制备；表征

　　分子印迹聚合物（MIP）的制备是在非质子溶液中，模板分子被包裹在聚合物基质中，洗脱去除模板分子，最后在聚合物中留下三维孔穴[1]。三维孔穴在形状、大小及功能趋势上与模板分子互补[2]。MIP具有良好的特异性识别功能，可以更好应用于样品的提取与分离。研究通过使用双模板分子印迹聚合物，采用HPLC-MS / MS法成功地提取和分离出槐果碱[3]。以甘草酸为模板分子成功制备出MIPs，并用HPLC测定其分离度[4]。MIP由于其高吸附性和高机械性能，通常被应用于固相萃取（SPE）中的农药残留检测[5]。普通MIP表面是疏水性的，这使得普通MIP无法通过氢键与水性介质中的模板分子完全结合，严重阻碍了在水性介质中的应用并且分子识别度不高[6]。亲水性分子印迹微球（HMIPs）比普通MIP更为广泛使用，因为HMIPs不仅可以应用于普通介质，而且在水性介质中也表现出极佳的性能[7]。近年来，通过不同方法成功制备出许多不同类型的HMIPs ，并将其应用于吸附和检测多种类型水溶液中的模板分子，例如河流和血清[ 8]。合成出天麻素超亲水性分子印迹聚合物，并将其成功的用于从水样中分离和纯化天麻素[9]。有研究表明，制备出磁性羧化纤维素纳米晶体表面上的氧氟沙星分子印迹聚合物，用于从水体中高度选择性吸附氟喹诺酮类[10]。沉淀聚合法由于其简单性和高效性是目前最有效的制备出HMIPs的方法之一[11]。采用沉淀聚合法可以制备出大小、形状均一的分子印迹微球，与没有任何表面活性剂或稳定剂的狭窄或单分散的颗粒相比，具有更佳的稳定性[12]。与多分散或纳米级的微球相比，具有均匀球形的微米级HMIPs更适合用作SPE吸附剂[13]。通过沉淀聚合法制备出的亲水性分子印迹微球，可以更好的控制聚合条件来调节制备的单分散微球的尺寸及孔隙率[14]。用于制备HMIPs的传统功能单体通常是疏水性的，需要其他共聚单体的参与才能提供亲水性基团[15]。然而，共聚单体的添加需要额外进行酸化过程，使得该方法既费时又复杂。甲基丙烯酸羟丙酯（HPMA）作为功能性单体，提供亲水基团可直接参与合成HMIPs，HPMA的加入使得合成过程更加简单和环保，也更符合“绿色化学”。

　　丁香菌酯是一种新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。该杀菌剂的使用范围广，且具有广谱性及高效性[16]。药效显著提高农作物品质和产量保障的同时，也为丁香菌酯在环境及食物中的残留超标埋下伏笔。因此，需要开发更为有效和灵敏度更高的检测方法来测定的丁香菌酯在环境中残留。以水体环境为例，通过沉淀聚合法采用丁香菌酯作为模板分子，并选择了HPMA作为亲水性功能单体用以合成亲水性丁香菌酯分子印迹微球。 因为HPMA作为功能单体提供亲水基团的同时，又可以为丁香菌酯分子印迹微球在水介质中表现出对丁香菌酯的高效识别能力，而制备HMIP的方法也更为简单，成本更低，效率更高。

　　1材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　97%丁香菌酯原药（沈阳化工研究院提供）；甲醇（北京化工厂）；乙酸（北京化工厂）；丁酮（阿拉丁试剂（上海）有限公司）；正庚烷（阿拉丁试剂（上海）有限公司）；正己烷（北京化工厂）；偶氮二异丁腈AIBN（北京化工厂）；乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA（阿拉丁试剂（上海）有限公司）；甲基丙烯酸羟丙酯HPMA（阿拉丁试剂（上海）有限公司）以上所有试剂均为分析纯。

　　KQ-250DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHZ-88型水浴恒温震荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂)；BS210S分析天平(德国赛多利斯集团)；UV-2450型紫外可见分光光谱仪（安捷伦科技有限公司）。

　　1.2 亲水性丁香菌酯分子印迹微球的制备

　　在HPMA为亲水性功能单体下，模板分子与功能单体的摩尔比例为1:4，以丁香菌酯为模板分子，EGDMA为交联剂，AIBN为热引发剂进行合成。具体操作步骤如下：称取0.5 mol丁香菌酯原药，2mol HPMA，10mol丁酮和正庚烷（V/V 6:4），将试剂混合于100mL 锥形瓶中超声波混匀，放置在25℃水浴锅中5h后形成预聚体。在预聚体中加入交联剂EGDMA 和热引发剂AIBN ，超声溶解。氮气除去氧气并密封。在60℃水浴锅中24h后得到分子印迹聚合微球（HMIMs）。将HMIMs中模板分子洗脱除去。非印迹聚合物微球（HNIMs）的制备方法同上，且不添加模板分子制得空白印迹微球。

　　1.3 分子印迹聚合物的形貌表征

　　通过使用扫描电子显微镜（TEM）对制备出的丁香菌酯亲水性分子印迹微球的形貌进行表征。微球的粒径的大小与分布通过激光分析仪研究。将100 mg 印迹微球与非印迹微球中精确加入100 mL 丙酮溶液。超声5 min，使得微球全部均匀分散在丙酮溶液中，开始进行粒度测试，测试结果可观察到粒径的大小及粒径的分布。

　　1.4 平衡吸附实验

　　分子印迹微球的吸附能力通过建立平衡吸附试验以进行研究。将HMIMs和HNIMs（20 mg）分别悬浮于不同浓度的丁香菌酯蒸馏水溶液（30 mg·L-1-900 mg·L-1，2 mL）中。丁香菌酯在助溶剂的作用下溶解于蒸馏水中。然后将混合物置于25℃水浴中，静置24 h后分层，取上层溶夜通过0.22 mm滤膜过滤。使用UV-2450光谱仪在322.5nm下测定获得样品的浓度。通过公式(1)计算微球的吸附容量。

　　(1)

　　在等式（1）中，Ci（mg∙L-1）是丁香菌酯的初始浓度，Cf（mg∙L-1）是达到吸附平衡后溶液中丁香菌酯的浓度，V（mL）是溶液的体积，M（mg）是微球的质量。Scatchard模型通常用于评估印迹微球的吸附能力，并拟合了聚合物中的吸附位点。

　　(2)

　　在等式中（2），Q（mg·g-1）为吸附平衡状态时，HMIMs和HNIMs对丁香菌酯最大吸附量，Qmax（mg·g-1）为结合位点的最大表观吸附量，Kd（mg·L-1）为Scatchard模型的平衡解离常数，C（mg·L-1）为吸附平衡状态下丁香菌酯的残留浓度。

　　(3)

　　为了更进一步研究HMIMs和HNIMs在平衡状态下的吸附机理，建立了Langmuir等温吸附模型[17]。在等式中（3），Qe（mg∙g-1）和Qmax（mg∙g-1）分别表示平衡时的吸附量和吸附作用点的最大表观吸附量。Ce（mg·L-1）和K1（mg·L-1）分别表示吸附平衡时丁香菌酯残留浓度和Langmuir平衡常数。

　　1.5 动力学吸附实验

　　分子印迹微球对丁香菌酯的吸附速率通过建立动力学吸附实验进行表征。 向HMIMs或HNIMs（20 mg）中加入丁香菌酯（60 mg·L-1，2 ml）的蒸馏水溶液。将悬浮液置于25℃水浴中分别5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130min。取上清液过0.22μm的滤膜。通过紫外分光光度计测定丁香菌酯浓度并计算其吸附量。根据拉格尔格伦动力学方程对微球吸附性进行研究。在等式中（4）Qe为吸附平衡时的吸附量（mg/g），Qt为测试各时间点印迹微球对丁香菌酯的吸附量（mg/g），K2是准2级动力学吸附常数（g•mg-1•min-1）。

　　(4)

　　1.6 选择性吸附实验

　　为了确定HMIMs和HNIMs对丁香菌酯的亲和力，使用两种相似的化合物吡唑醚菌酯和醚菌酯作为分析物，进行实验探究。将聚合物（20 mg）添加到分别包含模板分子或其他分析物（60 mg∙L-1，2 mL）的蒸馏水溶液中。然后将样品置于25℃水浴中24 h。将悬浮液通过0.22μm的滤膜过滤，并使用UV-2450分光光度器测定其剩余的浓度。

　　根据等式（5）、（6）对HMIM和HNIM的结合能力和选择能力，通过印迹因子（α）和选择因子（β）表达。其中QHMIM和QHNIM是HMIM和HNIM对模板或模板类似物的吸附能力。αtemplate和αanalogue分别代表模板和其他类似物在印迹聚合物上的印迹因子。

　　(5) (6)

　　2 结果与分析

　　2.1 丁香菌酯亲水性分子印迹微球的粒度表征析

　　对制备出丁香菌酯亲水性分子印迹微球进行粒径表征，主要使用激光粒度分析仪进行粒度分析。表1丁香菌酯亲水性分子印迹微球粒度分析，多分散性指数（U）越接近于1，微球的单分散性越好，根据表可以看出，HMIM1和HNIM1的U值分别为1.08和1.10，HMIM1与HNIM1粒径值更好。在粒径分布范围内，含有一个粒度峰说明为单分散微球。根据粒径分布图可以清晰看出，在HMIM1与HNIM1为典型的单分散微球，说明其印迹微球具有良好的单分散性。此外，从图1可以看出，HMIM1和HNIM1的粒径图与HMIM4和HNIM4的粒径图相比，HMIM4和HNIM4的粒径分布较差，且不呈正态分布，因为HNIM4印迹微球的大小不均匀，部分粘连导致的，电镜结果也验证此实验结果。根据公式（7）中体积平均径（Dv）和平均粒径（Dn），计算HMIMs的多分散性指数（U）。

　　（7）

　　表1 HMIMs和HNIMs的粒径及U值

　　Tab.1 The partclesize and U of HMIMs and HNIMs

　　图1 HMIM1和HNIM1的粒径图与HMIM4和HNIM4的粒径对比图

　　Fig. 1 HMIM1 and HNIM1 particle size maps versus HMIM4 and HNIM4 particle sizes

　　2.2 扫描电镜表征及其分析

　　由图2可知，采用沉淀聚合法制备出丁香菌酯亲水性HMIM1（A）与HNIM1（E）分子印迹微球，外形良好，表面呈现光滑，没有缺陷以及破损，大小、粒径较为均匀，通过扫描电镜观察出丁香菌酯亲水性分子印迹微球分布均匀且紧密、并且呈现出良好层。各微球之间作用力大小相同，制备出丁香菌酯亲水性分子印迹微球分散性良好，化学性能较强且拥有高负载量，同时存在底物识别性能高的优势。此外，HMIM4（C），HNIM4（F），HMIM(B)和HNIM(D)均出现了不同程度的粘连现象。这表明丁酮和正庚烷的混合溶剂（6：4，v/v）是丁香菌酯亲水性印迹微球合成的最佳比例。

　　图2 HMIMs与HNIMs扫描电镜图

　　Fig .2 HMIMs and HNIMs SEM

　　2.3 平衡吸附能力研究和Scatchard分析

　　在传统分子印迹分析中，Scatchard方程分析对于印迹聚合物的特异性结合具有较高的研究价值，根据图3可以看出，通过平衡吸附实验对最佳比例下的HMIMs和HNIMs的吸附性能进行研究。由图可以看出，刚开始时HMIMs与HNIMs的吸附量迅速增加，当吸附位点被占据后，吸附趋于平缓，最后吸附达到平缓状态，并且HMIMs的吸附量始终高于HNIMs的吸附量。这个结果表明：HMIMs中含有一定的特异性结合位点，其吸附性能高于HNIMs中非特异性结合位点。

　　图3 HMIM与HNIM的平衡吸附曲线

　　Fig.3 equilibrium adsorption curves of HMIM and HNIM

　　图4可知，

　　使用Q/C对Q作图，丁香菌酯亲水性分子印迹微球回归方程是y=-0.0105x+0.6596，r2 =0.9603，空白印迹微球回归方程是y=-0.0041x+0.1745，r2 =0.6960。HMIMs的平衡离解常数为 95.24 mg/L，HMIMs吸附位点的最大的表观结合量为62.82 mg/g。而HNIMs的平衡离解常数243.90 mg/L，HNIMs吸附位点的最大的表观结合量为42.56 mg/g。结果表明，丁香菌酯分子印迹微球具有明显线性关系，并且HMIMs的吸附性能高于HNIMs，说明丁香菌酯亲水性分子印迹微球具有特有选择性的吸附位点，同时表现出均匀亲和力。

　　图4 HMIM和HNIM的Scachard模型拟合曲线

　　Fig.4 Scachard model fitting curves for HMIM and HNIM

　　根据平衡吸附的数据绘制朗格缪尔吸附等温线。结果如图5所示，以Ce/Qe对Ce作图，HMIMs和HNIMs的线性方程分别为y=0.0166x+1.4154和y=0.0232x+6.117。结果表明，HMIMs吸附位点有相同的吸附性能，说明了HMIMs对丁香菌酯的吸附是特异性的。

　　图5 HMIM和HNIM的Langmuir模型

　　Fig.5 Langmuir isotherm model for HMIM and HNIM

　　2.4 动力学研究

　　在平衡吸附实验的基础上，还研究分析了丁香菌酯亲水性分子印迹微球在不同时间的吸附量。HMIMs与HNIMs对丁香菌酯的动力学研究。结果如图6所示，在测试期间，从5~30 min内开始，吸附量就在不断增加，增加到一定的趋势时达到顶峰，随后吸附量趋于饱和，充分说明在开始时，丁香菌酯亲水性分子印迹微球与空白印迹微球中含有大量未结合的特异性与非特异性的识别位点，使得丁香菌酯与这些识别位点快速结合。随着吸附位点不断被占据，达到吸附平衡。

　　图6 HMIM和HNIM的动力学吸附曲线

　　Fig.6 Binding kinetic curves of HMIM and HNIM

　　通过准二级动力学吸附方程对动力学吸附原理进一步研究，研究了HMIMs对丁香菌酯的吸附。由图可知，准二级方程线性方程t/Q=0.1816t+0.5452，相关系数R2为0.9982，Qe为5.51 mg/g，K2为0.0604 g•mg-1•min-1。由HMIMs对丁香菌酯的准二级动力学吸附曲线可以看出其动力学吸附线性良好，证明了其吸附过程属于化学吸附。

　　图7 准二级动力学吸附曲线

　　Fig.7 Quasi-second-order kinetic adsorption curve

　　2.5 选择性吸附研究

　　选取与丁香菌酯结构相似的杀菌剂进行选择性吸附实验。醚菌酯与吡唑醚菌酯均为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂且结构相似。如图8所示，根据α和β可以看出，HMIMs对三种样品的识别能力均有不同。HMIMs对蒸馏水中的丁香菌酯具有较高的特异性识别能力。而HMIMs对醚菌酯的识别能力低于对吡唑醚菌酯的识别能力，是由于醚菌酯的化学结构与吡唑醚菌酯相比更接近丁香菌酯。此外，HNIMs对三种样品的吸附量相近，是因为HNIMs中的识别位点为非特异性，所以HNIMs对醚菌酯与吡唑醚菌酯的吸附能力相近。

　　丁香菌酯

　　Eugenyl

　　吡唑醚菌酯 醚菌酯

　　Pyrazolium Ethereal

　　图8丁香菌酯，醚菌酯，吡唑醚菌酯的结构式

　　Fig .8 Structural formula of eugenyl ester, etheric ester, pyrazole ester

　　表2 HMIMs和HNIMs对模板及类似物的吸附量、印迹因子及选择性因子

　　Table 2HMIMs and HNIMs adsorption capacity, imprinting factors and selectivity factors for templates and analogues

　　3 讨 论

　　丁香菌酯亲水性分子印迹微球通过沉淀聚合法合成，此方法相对于传统方法相比，实验过程所使用的时间少且制备方法简单，能制备特异性识别丁香菌酯亲水性分子印迹微球，微球数量较多且分布均匀。由扫描电镜对丁香菌酯亲水性分子印迹微球的表征结果可以看出微球的大小均匀、形状规则且为分散性良好的球形。通过粒径表征可以观察到其为单分散性微球。通过平衡吸附实验对吸附量的研究和分析可以看出吸附点均匀，丁香菌酯亲水性分子印迹微球在水溶液中具有较大的吸附量，属于化学吸附。制备出的丁香菌酯亲水性分子印迹微球对于模板分子具有印迹能力，这有利于微球和吸附位点的相接触，吸附速率快，同时存在着底物识别性能高的优势，该研究主要使用了分子印迹技术制备了丁香菌酯亲水性分子印迹微球，通过一系列表征和分析得到了较好的效果，在以后的应用中也具有很高的应用价值。