沧州地区PCOS患者中LIF、HOXA10的表达及意义

　　沧州地区PCOS患者中LIF、HOXA10的表达及意义

　　芦春宇1、孙金豹1、崔娜1、郭金玲1、戴慧雅1

　　1沧州市人民医院生殖科 061000

　　目的：探讨沧州地区PCOS患者不同组织学分期的子宫内膜LIF、HOXA10的表达情况与子宫内膜容受性的关系。方法：50例已婚PCOS患者和26例已婚不孕症（非PCOS）患者在月经周期第9天及排卵后第8天采集其子宫内膜标本，采用免疫组织化学法检测内膜LIF、HOAX10的表达。结果：LIF、HOXA10在PCOS组增生期及分泌中期子宫内膜的表达水平均低于其相应的对照组（p<0.01）。结论：检测PCOS患者中LIF、HOXA10可为PCOS不孕患者临床细胞因子的综合诊断及治疗提供新思路。

　　关键词：多囊卵巢综合征(PCOS); 子宫内膜; 白血病抑制因子(LIF)；同源框基因A10（HOXA10）

　　多囊卵巢综合征（P-COS）是目前排卵障碍性不孕症较为常见的原因之一，近年来关于子宫内膜容受性标记物的研究已经成为不孕症研究的焦点。我们把近年来50例已婚PCOS患者和23例已婚不孕症（非PCOS）患者在月经周期第9天及排卵后第8天采集其子宫内膜标本及血清标本，采用免疫组织化学法检测内膜LIF、HOAX10的表达。探讨沧州地区PCOS患者不同组织学分期的内膜LIF、HOXA10的表达情况与子宫内膜容受性的关系。拟为沧州地区PCOS不孕患者临床细胞因子的综合诊断及治疗提供新思路。

　　1  资料与方法

　　1.1 研究对象

　　1.1.1 PCOS组 收集2010.10~2015.2期间在沧州市人民医院生殖中心就诊的50例已婚PCOS患者，平均年龄28.5±4.3 (23~35)岁，作为病例组成员。纳入标准:PCOS诊断符合2003年鹿特丹修正的诊断标准；经治疗3~9个月后，基础内分泌测定正常，月经规则, 自然周期排卵或使用促排卵治疗后可正常排卵；阴道B超未显示子宫及卵巢有器质性病变存在，不合并子宫内膜异位症；丈夫精液检查正常。

　　1.1.2 对照组 收集同期就诊的已婚不孕症患者26例(不孕原因为男方因素或输卵管梗阻，拟在外院行体外受精-胚胎移植治疗)，平均年龄28.2±4.1(25~40)岁。纳入标准：月经规律, 排卵正常；基础内分泌测定正常；阴道B超未显示子宫及卵巢有器质性病变存在，不合并子宫内膜异位症；近3个月未用过激素类药物。两组患者年龄无显著性差异，P>0.05。

　　1.2 方法

　　1.2.1 治疗方案及标本采集

　　PCOS组于自然周期的（增生期）第9日和自然周期排卵或使用氯米芬(CC)/hMG/hCG方案促排卵周期的着床窗口期(阴道超声监测确认排卵后（分泌中期）8d, 血b-hCG证实未孕。对照组于自然周期的9d和自然周期排卵或促排卵周期(方案同上)的着床窗口期 (阴道超声监测确认排卵后8d，血b-hCG证实未孕)，无菌操作下使用Pipelle管(江苏苏云医疗器材有限公司)吸刮子宫前、后壁, 采集子宫内膜标本。将组织迅速置于体积分数10%多聚甲醛中固定，常规梯度酒精脱水后石蜡包埋, 切片(4 mm)，送本院病理科行HE染色和免疫组织化学染色。根据Noyes标准判定组织学分期。本研究沧州市人民医院生殖伦理专业委员会讨论批准, 标本提供者均签署知情同意书。

　　1.2.2 组织学分组

　　根据所采集子宫内膜标本的组织学分期，将PCOS组和对照组进一步分为增生期亚组、分泌中期亚组。

　　1.2.3子宫内膜LIF、HOXA10的表达

　　采用免疫组织化学SP法, 组织切片脱蜡, 抗原热修复后分别加入一抗LIF (羊抗人白血病抑制因子多克隆抗体,工作浓度为1:50, 美国Santa Cruz公司)、HOXA10 (羊抗人白血病抑制因子多克隆抗体,工作浓度为1:50, 美国Santa Cruz公司), 4℃过夜, 滴加生物素标记的第二抗体 (羊抗鼠工作液, 北京中山生物技术有限公司), DAB显色剂显色, 苏木素复染, 体积分数1%盐酸酒精分化, 梯度酒精脱水, 封片。

　　1.2.6 结果判定和图像分析

　　LIF、HOXA10免疫组织化学染色阳性均表现为细胞质有棕黄色颗粒者, 以免疫组织化学试剂盒(北京中山生物有限公司)中的已知阳性片作为阳性对照, 使用PBS 代替一抗作为阴性对照。 每张切片随机选取不重叠的5个高倍镜视野(40×10倍), 使用Powersite显微图像采集分析系统分别测量每高倍镜视野下LIF、HOXA10阳性区平均光密度值, 以每例子宫内膜标本LIF、HOXA10的平均光密度值(OD)表示LIF、HOXA10在各组子宫内膜的表达水平。

　　1.3 统计学分析

　　各组参数以均数±标准差(x±s)或率(%)表示，实验数据均应用SPSS17.0 统计软件进行统计分析, 以a=0.05 作为差异有无统计学意义的检验水准。

　　结果：

　　表1研究对象子宫内膜LIF、HOXA10的表达情况(x± s)

　　*: P<0.05, **: P<0.01, 与对照组相比

　　#: P<0.01, 与分泌中期相比

　　LIF、HOXA10在子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的胞质中均呈阳性表达, 以腺上皮细胞的胞质表达为主。LIF、HOXA10在PCOS增生期和分泌中期子宫内膜的表达水平均低于其在相应的对照组子宫内膜的表达水平(P<0.01); 而组内比较分泌中期LIF的表达水平均高于增生期(P<0.01)。

　　讨论

　　多囊卵巢综合征（P-COS）是目前排卵障碍性不孕症较为常见的原因之一，近年来关于子宫内膜容受性标记物的研究已经成为不孕症研究的焦点。LIF、HOXA10可能与多囊卵巢综合征（P-COS）是目前排卵障碍性不孕有一定的关系。

　　白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）是一种具有广泛生物学功能的细胞因子, 是白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)家族的一员。LIF在正常增生期和分泌期的子宫内膜中均有表达, 其表达主要定位于腺上皮细胞和间质细胞的胞质, 以腺上皮细胞的胞质表达为主, 与Tsai等的报道一致[1]。LIF在PCOS患者子宫内膜的表达和调节PCOS患者临床表现为不孕, 促排卵后妊娠率低而流产率高。, Ding等研究表明[2], 雌激素能诱导金仓鼠子宫内膜中LIF的表达增加, 而孕酮则诱导LIF受体(LIFR)的产生。潘一红等研究提示[3]: LIF受E2所调控, 过高或过低的E2都抑制LIF的分泌。此外, LIF可上调IGFBP-3的产生[4], 是否低水平的IGFBP-3同样可下调LIF的产生而影响PCOS患者的内膜容受性, 尚未见报道。同源框基因（homeobox gene，HOX）是一类转录调节因子。是参与子宫内膜容受性建立及子宫内膜增殖分化的重要指标。最近，Penna等[5]认为HOXA10调节ET(A)在子宫内膜的表达。HOXA10对于子宫内膜容受性的建立和胚胎植人不可缺少，并对蜕膜化过程起关键的调节作用[6]。

　　本研究结果显示LIF在沧州地区PCOS组各期子宫内膜中均有表达, 主要表达于腺上皮细胞的胞质, 呈现周期性变化。但LIF在PCOS组的表达呈现不均匀分布的现象, 且在分期相同的子宫内膜，沧州地区POCS组LIF的表达水平明显低于正常对照组。LIF的生成与性激素关系密切

　　本研究结果显示: LIF在沧州地区PCOS患者子宫内膜的低表达状态可能参与了PCOS患者子宫内膜容受性下降的某个环节和途径。因此, 设想可以此为依据, 通过外源性补充重组人LIF, 以提高PCOS等不孕症患者的内膜容受性, 降低其流产率, 改善其不良的生殖结局。

　　综上所述，PCOS复杂的代谢及内分泌变化，引起了沧州地区PCOS患者中LIF、HOXA10含量的变化，打破子宫内膜组织稳态而导致子宫内膜容受性下降，即使经药物治疗纠正代谢及内分泌变化后，PCOS的子宫内膜容受性仍受到影响。对影响PCOS子宫内膜容受性各种细胞因子进行深入研究并探究各影响因素之间的相互关系，可能会对治疗PCOS患者的低妊娠率高流产率寻找新的途径提供帮助。

　　[1] Tsai HD, Chang CC, Hsich YY, et al. Leukemia inhibitory factor expression in different endometrial locations between fertile and infertile women through-out different menstrual phases. Assit Reprod Genet, 2000, 17(8):415-8.

　　[2] Ding TB, Song H, Wang XH, et a1. Leukemia inhibitory factor ligand receptor signaling is important for uterine receptivity and implantation in golden hamsters (Mesocricetus auratus).J Reproduction, 2008, 135(1):41-53.

　　[3] 潘一红, 刘建兵, 高文, 等. 卵泡液中白血病抑制因子(LIF)和血清中E2 在早期胚胎发育中的作用. 生殖与避孕,2008, 28(8):496-9.

　　[4] Sherwin JR, Freeman TC, Stephens RJ, et al. Identification of genes regulated by leukemia-inhibitory factor in the mouse uterus at the time of implantation. Mol Endocrinol, 2004, 18(9):2185-95.

　　[5] Penna IA， Hongling Du，Kallen AN，et a1.Endothelin type A receptor (ETA) expression is regulated by HOXA10 in human endometrial stromal cells[J]. Rep rod Sci，2010，17(5)：471-476.

　　[6] Modi D，Godbole G.HOXA10 signals on the highway through peg nancy[J].J Reprod Immunol，2009，83(1/2)：72-78.